Encyklopedia Host

Użyte słownictwo.

Mikronamnażanie - mikropropagacja - ang. mikropropagation - ang. tissue culture - tożsame z namnażaniem, mnożeniem roślin w laboratorium "in vitro", czyli kultury tkankowe roślin. Kultury tkankowe polegają na mnożeniu tkanek, komórek roślin i innych organizmów,
także zwierzęcych, w sterylnych warunkach na sztucznych pożywkach, często w szklanych pojemnikach.
Eksplant - część rośliny wyizolowana (t.j. wycięta, wydłubana, odcięta) z całej rośliny w celu położenia jej na pożywkę startową indukującą, rozpoczynającą proces namnażania rośliny. Eksplantem najczęściej jest merystem. Eksplantem może też być śpiący pąk np. w kącie między łodygą a liściem. Ale także fragment liścia u niektórych roślin lub sam szczyt korzonka.
Merystem - to skupisko komórek najszybciej namnażających się w tym momencie w roślinie. To np. pąk szczytowy, wierzchołek.
Czas ekspozycji - czas przez jaki dana rzecz jest np. traktowana jakimiś chemikaliami. Jaki czas np. moczymy, płuczemy, natryskujemy część rośliny w środkiem dezynfekującym przy izolacji merystemu.
Fitotron - Klimatyzowana komora (pomieszczenie) do hodowli roślin. Wykorzystywana jest w laboratoriach, gdzie w kontrolowany sposób symulowane są zmienne warunki klimatyczne i fizyczne (zmiany temperatury, oświetlenia czy wilgotności).

Wstęp

Mikropropagacja czyli rozmnażanie roślin in vitro na dużą skalę rozpoczęła się około 1970 roku.
Od tego czasu metoda ta stała się niezastąpioną przy namnażaniu wartościowych odmian roślin.
Jest to prawdopodobnie najbardziej rozwijająca się gałąź branży rolno-ogrodniczej z wieloma powstającymi na całym świecie nowymi firmami każdego roku.
Ocenia się że każdego roku laboratoriach in vitro namnaża około 500 gatunków w ilości ponad miliard.
Coraz więcej gatunków roślin, w tym wiele o dużym znaczeniu gospodarczym, jest rozmnażanych na skalę komercyjną właśnie metodą kultur tkankowych, m.in. trzcina cukrowa, migdałowiec, banan, cytrusy, palma daktylowa, kawa, ananas, eukaliptus, bambus, ziemniak, czosnek, winorośl, brzoskwinia, truskawka, róża, śliwa, morela, jabłoń, orzech włoski.
Dużą grupę mnożonych roślin stanowią rośliny ozdobne jak gerbery, storczyki, fikus, paprocie, lilie oraz różnego rodzaju byliny, w tym Hosta.

Zalety metody

Mikronamnażanie ma wiele zalet w porównaniu do z innymi metodami mnożenia roślin.

• odmiana może być namnażana bez utraty często unikalnej rośliny matecznej. Może to być spontaniczny mutant lub roślina pochodząca ze skrzyżowania dwóch odmian.
• otrzymane sadzonki mogą być praktycznie identyczne z rośliną mateczną.
• można mnożyć rośliny które rzadko dają nasiona lub ich nasiona słabo kiełkują.
• materiał roślinny można mnożyć z dala od jej naturalnego środowiska.
• możliwość uwalniania materiału hodowlanego od wirusów i innych patogenów. Im mniejszy jest izolowany merystem (0,5 do 1 mm), tym większa skuteczność eliminacji wirusów. W celu zwiększenia prawdopodobieństwa otrzymania zdrowych roślin stosuje się termoterapię lub chemoterapię merystemów.
• można uzyskać bardzo dużą ilość sadzonek w relatywnie krótkim czasie.
• proces mnożenia jest niezależny od pogody i może być kontynuowany przez cały rok.
• łatwy transport rozmnożonego materiału. Szacunkowo około 40 000 roślinek można umieścić w paczce ważącej 15 kg.
• ułatwiona wymiana międzynarodowa. Wiele krajów stosuje uproszczoną procedurę fitosanitarną przy imporcie roślin mnożonych in vitro a także umożliwia ich eksport zgodnie z konwencją CITES - chodzi o eksport gatunków roślin którym grozi wyginięcie.
• możliwość przechowywania mikro-roślinek przez kilka miesięcy w obniżonej temperaturze. Pozwala to na spokojną, rozłożoną w czasie produkcję in vitro i wysadzanie dużej ilości roślin w optymalnym terminie.
• rośliny z laboratorium często wykazują lepszą juwenilność i mocniej się krzewią. Juwenilność prawdopodobnie wynika z obniżenia ilości bakterii współżyjących z organizmem rośliny w ich wiązkach przewodzących, a podatność na krzewienie jest następstwem stosowania hormonów w trakcie mnożenia.

Wady metody.

Mikronamnażanie ma też i wady.

• jest to droga metoda pozyskiwania sadzonek. Średnia cena rośliny z in vitro wynosi 0,30 €, a nawet sięga wysokości 1 €, w przypadku banana czy Phalaenopsis. Rośliny truskawki z in vitro kosztują 0,50 € za sztukę. Koszt produkcji zależy głównie od rodzaju rośliny i od kosztów pracy.
• niezbędny jest dobrze wykwalifikowany personel i duże doświadczenie personelu zarządzającego.

Przy stosowaniu metody polegającej na mnożeniu pędów bocznych, z każdej uzyskanej przez podział kępki, można otrzymać często cztery nowe mikro rośliny w ciągu 6-ciu tygodni, co daje 1 000 000 sadzonek w ciągu 12 miesięcy. Przy żadnym ze znanych tradycyjnych sposobów wegetatywnego mnożenia nie otrzymuje się tak intensywnego namnożenia w tak krótkim czasie. Jednak są odmiany Hosta których współczynnik namnażania z trudnością dochodzi do dwóch.

Jednak taka ilość i ich dobra jakość może być osiągnięta jedynie przy dobrej znajomości fizjologicznej reakcji komórek tkankowych na sposoby traktowania ich w czasie produkcji w laboratorium.
Jakkolwiek w laboratorium stosunkowo łatwo regulować można wieloma parametrami otoczenia to jest temperaturą, rodzajem i intensywnością światła, długością dnia, składem powietrza, składem chemicznym pożywki, rodzajami i stężeniem stosowanych hormonów, to jednak potrzeba wielu lat badań aby uzyskać zadawalające wyniki mikronamnażania ekonomicznie ważnych odmian roślin. Właściwie ta gałąź agrotechniki jest dopiero w stadium rodzenia się, kiedy ją porównamy z tradycyjnymi technologiami mnożenia roślin rozwijanych przez ludzkość tysiące i lat.

Skład pożywki.

Podstawowa syntetyczna pożywka, na której hoduje się rośliny składa się z wody, soli mineralnych (makro i mikro elementów), hormonów, witamin, cukru oraz żelującej substancji zwanej agar-agar.
Pożywka musi być każdorazowo modyfikowana i przetestowana dla każdego rodzaju rośliny zgodnie z jej wymaganiami w kolejnych stadiach hodowli to jest mnożenia, wzrostu, korzenienia oraz innych, wymaganych w trakcie produkcji.
Pożywkę wlewa się do różnego typu transparentnych pojemników jak probówki, słoje, pojemniki plastikowe.
Do pojemnika wlewa się przeciętnie 50-60 ml pożywki. Pojemniki po ich zamknięciu sterylizuje się w autoklawie, w temperaturze 121 C przez 20 minut. czytaj więcej

Wprowadzenie roślin do kultur tkankowych.

Jako że kultury in vitro są prowadzone zasadniczo w warunkach sterylnych, przy wprowadzaniu eksplantu do kultur tkankowych niezbędna jest procedura umożliwiająca eliminację możliwych zakażeń powierzchni eksplantu. Chodzi o takie organizmy jak grzyby, bakterie i algi. Dla osiągnięcia czystych eksplantów stosuje się popularnie podchloryn wapnia Ca(OCl)2, dwutlenek chloru ClO2, podchloryn sodu NaOCl, chlorek rtęci Hg2Cl2. Stosowane stężenia i czas sterylizacji zależy od rodzaju rośliny, od jej kondycji, wieku i innych czynników.
Skuteczność sterylizacji zależy od rodzaju izolowanej części rośliny. Generalnie merystemy i części roślin naturalnie usytuowanych nad ziemią łatwiej i w większym procencie poddają się temu procesowi. Hosta jest stosunkowo łatwa do izolacji merystemów, ponieważ schowane są one za nasadą liści, nie są one w bezpośrednim kontakcie z podłożem.

Natomiast dużym problemem sterylności Host w kulturach tkankowych jest natężenie bakterii endogennych w tkankach przewodzących tych roślin. Są to bakterie naturalnie współżyjące z rośliną i w naturalnych warunkach prawdopodobnie nie są dla rośliny szkodliwe. W procesie sterylizacji merystemu udaje się nam najczęściej doprowadzić do tego że przez kilka miesięcy rośliny wydają się być sterylnymi. Jednak z czasem pojawiają się jak gdyby zamglenia na pożywce w otoczeniu mnożonych roślin. Być może że bakterie z czasem przystosowują się do zasiedlenia podłoża agarowego lub też ich populacja rośnie. Jest to naturalny proces przy produkcji w laboratorium. Teoretycznie bakterie te nie są szkodliwe dla roślin, ale podłoże agarowe ulega pewnym zmianom poprzez działanie tych bakterii i ma to negatywny wpływ na sam proces namnażania czy fazy korzenienia. Z tego powodu laboratorium musi mieć dostęp do zdrowego matecznego materiału roślinnego by móc w miarę konieczności powtórzyć izolację odmiany i wprowadzić nowy, czysty merystem do kultur.

Rośliny mateczne są obserwowane pod względem zgodności ich cech morfologiczne i fizjologicznych z cechami rośliny matecznej. W przypadku Hosty, ale też innych roślin, mateczne rośliny, a szczególnie te, wprowadzane do kultur tkankowych obowiązkowo testowane są na obecność wirusów. Dla Hosty ostatnio preferowany jest test ImmunoStrip st firmy Agdia wykrywający obecność groźnego, rozprzestrzeniającego się wirusa Hosty HVX.

Merystem w fitotronie po okresie około miesiąca, w tym czasie niejednokrotnie przebywając jakiś czas w ciemności, tworzy na pożywce mikro-roślinkę, która powoli staje się małą krzewinką.

Mnożenie in vitro przez podział.

Cyklicznie, co około sześć tygodni kultywowania roślin w fitotronie, małe rośliny w fazie krzewienia, podlegają podziałowi w celu wyodrębnienia przybyszowych nowych roślinek. Podzielone roślinki przekładane są do nowych sterylnych pojemników z pożywką.

Jak wszystkie operacje na sterylnym materiale roślinnym, tak i ta wymaga zachowania wielu środków ostrożności, umożliwiających zachowanie materiału roślinnego w stanie sterylny.
Praca przebiega zawsze w tzw. komorach z laminarnym przepływem sterylnego powietrza. Nad stołem do pracy przepływa podawane wentylatorem powietrze filtrowane, pozbawione w 99,99% zanieczyszczeń większych od 0,2 µ. Zabezpiecza to przed możliwością wnikania otaczającego powietrza i oddechu manipulującej osoby w strefę pracy. Narzędzia jak skalpele, pęsety i są często sterylizowane w alkoholu i opalane w temp. około 600 C.

Jednak zawsze jakiś procent pojemników podlega z różnego powodu zakażeniom. Pojemniki są cykliczne sprawdzane w fitotronie a zakażone przed ich opróżnieniem sterylizowane. Istnieje niebezpieczeństwo wyhodowania wyspecjalizowanych szczepów czynników zakażających mogących poważnie utrudnić pracę w przyszłości.

Po okresie mnożenia, lub w jego trakcie, w zależności od planu produkcji wynikającego z napływających lub nie zamówień, przy kolejnym cyklu dzielenia partię roślin po podziale przekłada się na pożywkę ukorzeniającą. Różni się ona od namnażającej składem hormonów, czasem też stężeniem soli zawartej w pożywce. Każde laboratorium, chcąc sprostać w terminie na zamówienia odbiorców zmuszone jest prowadzić stałe badania pozwalające na doskonalenie metod prowadzenia produkcji, szczególnie musi dopracowywać składy pożywek stosownie do wymagań gatunków roślin, ale także często do wymagań poszczególnych odmian.

Proces korzenienia trwa zależności od gatunku rośliny, a czasem od odmiany 6 do 8 tygodni. Po tym czasie rośliny mogą być wyjęte z pojemników i po ich opłukaniu z resztek agaru posadzone do substratu.
Moment aklimatyzacji roślin do warunków uprawy w gruncie jest bardzo stresujący dla rośliny. W tym czasie roślina musi nauczyć się fotosyntezy, wykształcić aparaty szparkowe pozwalające na wymianę gazową. W warunkach laboratoryjnych rośliny w małym stopniu korzystają z naturalnego procesu fotosyntezy, ponieważ związki organiczne budując przy wykorzystaniu dodawanego do pożywki cukru. Hosta należy do roślin stosunkowo łatwo przechodzących ten okres.

Opis tej metody mnożenia jest z konieczności uproszczony. Jest to relatywnie prosta metoda do momentu podjęcia się produkcji komercyjnej, kiedy dochodzi do konieczności dostarczenia sadzonek w dokładnie określonym terminie.
Po drodze można spotkać odczynniki chemiczne przy których produkcji nie dotrzymano procedur technologicznych, błędy aparatur sterujących i pomiarowych, awarie systemów klimatyzacyjnych, pomyłki przy oznaczaniu roślin w laboratorium, a bywa że jest tysiąc różnych linii w produkcji, awarie systemów pozyskiwania absolutnie czystej wody, nieprawidłowe przebiegi procesów sterylizacji, mutacje roślin, wracanie ich cech w kierunku genotypu roślin matecznych, okresy dormancji roślin, zmienność popularności odmian a w związku z tym zamówień i inne. Ten milion roślin możliwych do uzyskanie, wymieniony na początku, to nie do końca prosta sprawa.

Jerzy Foszczka

Serdeczne podziękowania dla Pana Jerzego Foszczki za opisanie
metody rozmnażania w laboratorium in vitro na stronie "Encyklopedii Host".
Jest on autorem zarówno artykułu jak i wszystkich, zamieszczonym w nim zdjęć.

Andrzej Pach

Aby w pełni przybliżyć tą metodę rozmnażania poniżej przedstawiam galerię zdjęć z laboratorium in vitro.